Abstract

DYNAMICS OF PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF FIBERS OF PLASMA AND BLOOD SERUM OF ATHLETES UNDER INFLUENCE OF DIFFERENT DOZES OF ULTRA-VIOLET IRRADIATION

E.V. Yeliseyev, Dr. Biol., professor

A.V. Beloedov, lecturer

M.P. Popovskikh, lecturer

The Southern-Ural state university, Chelyabinsk

Key words: fibers of plasma and blood serum , physical and chemical properties of fibers, ultra-violet irradiation, noise stability of blood system of athletes.

The comparative analysis of the changes of chromatographic behaviour and viscosity of separate fractions of fibers after an ultra-violet irradiation (240-390 nanometers) of plasma and blood serum of athletes has revealed the lower photo noise sensitivity of plasma in comparison with the blood serum that allows the ideas of the functional theory of noise stability of an organism to be broadcasted to the sphere of transfusion medicine.

ДИНАМИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ И СЫВОРОТКИ КРОВИ СПОРТСМЕНОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ РАЗНЫХ ДОЗ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ

Доктор биологических наук, профессор Е. В. Елисеев
Преподаватель А. В. Белоедов
Преподаватель М. П. Поповских

Южно-Уральский государственный университет, Челябинск

Ключевые слова: белки плазмы и сыворотки крови, физико-химические свойства белков, ультрафиолетовое облучение, помехоустойчивость системы крови спортсменов.

Введение. Белковый состав плазмы и сыворотки крови человека весьма разнообразен. Методом электрофореза на разных носителях удается выделить от 5 до 50 белковых компонентов сыворотки [7]. Плазма крови содержит еще большее количество белков, так как включает в свой состав белки свертывающей системы [12].

Белки крови содержат значительное количество хромофоров ультрафиолетового излучения (УФИ) - ароматические и серосодержащие аминокислоты, вследствие чего они обнаруживают чувствительность к УФИ и при его действии подвергаются фотохимическим превращениям. Изменения структуры белков находят отражение в изменении спектров поглощения сыворотки и плазмы крови. Анализ этих спектров использовался фотобиологами для оценки влияния УФИ на белки крови [1, 5, 8, 13]. Так, спектр поглощения сыворотки крови человека и животных имеет 2 максимума - при 210 и 280 нм, интенсивность которых возрастает после воздействия ультрафиолетовых лучей (УФЛ) [1, 8]. Данный процесс, сопровождается нарастанием количества сульфгидрильных групп [5]. Изменение степени поглощения раствора сыворотки зависит от дозы

УФИ и температуры, при которой проводится облучение [8]. Снятие дифференциальных спектров поглощения позволило выявить образование новых фотопродуктов с четко выраженным максимумом при 235 нм после действия УФИ в невысоких дозах [1]. Установлено, что спектр поглощения плазмы крови человека после ультрафиолетового облучения (УФО) в дозах, близких к тем, что используются при аутотрансфузии ультрафиолетовооблученной крови (АУФОК), меняется как за счет изменения структуры ее белков, так и за счет поступления в нее компонентов клеточной поверхности [13].

Существенная роль белков в крови спортсмена, с одной стороны, и широкое применение в клинической практике, в частности в спортивной медицине, метода АУФОК - с другой, в первую очередь ставит задачу глубокого и всестороннего изучения механизмов действия разных доз УФО на динамику физико-химических свойств белков крови спортсменов. В настоящем сообщении приводятся результаты сравнительного анализа количественного содержания, относительной вязкости и хроматографического поведения белков отдельных фракций интактной и УФ-модифицированной плазмы и сыворотки крови спортсменов. Предлагаемое ниже исследование организовано и проведено нами в русле расширения фактологической базы и укрепления научно-экспериментального обоснования функциональной теории помехоустойчивости организма, а также для показа возможностей трансляции идей в трансфузиологию [8].

Объем, материалы и методика исследования. Исследовали белки плазмы и сыворотки 27 образцов крови спортсменов 19 - 21 года со стажем занятий игровыми видами спорта свыше 5 лет. Данные образцы крови считали образцами донорской крови, белки плазмы которой стабилизировали цитратом натрия. Исследовались также водные растворы кристаллического препарата (n=16) сывороточного альбумина человека (6,79х10-4М).

Образцы плазмы и сыворотки облучали при постоянном перемешивании в термостатируемой кювете (37±1°С) УФЛ полного спектра (240 - 390 нм), которые получали от лампы ДРТ 375 в сочетании со светофильтром УФС-1. При энергетической облученности 2,51 Вт/м² дозы облучения составляли 75-2416 Дж/м², т. е. были близки к тем, что применяются в аппаратах "Изольда" [10]. В качестве контроля применялись образцы плазмы и сыворотки крови тех же спортсменов, но без воздействия на них моделируемых УФЛ.

Содержание общего белка в образцах крови определяли по методу Лоури [12]. Фракционный состав белков исследовали методом тонкослойной хроматографии на сефадексе G-200, используя в качестве элюирующего раствора трис-глициновый буфер, рН 7,4 [2, 11]. Содержание белка в отдельных фракциях выражали в процентах от его суммарного количества.

О модификации структуры белков судили по изменению величины скорости движения отдельных фракций (Rf), обусловленной формой и размерами исследуемых молекул. Кроме того, исследовали вязкость выделенных фракций белков, которую определяли капиллярным вискозиметром, разработанным на кафедре биофизики Воронежского госуниверситета [4].

Величину относительной вязкости рассчитывали по скорости протекания через вискозиметр одинаковых объемов раствора белка и растворителя [6]. Плотность фракций определяли пикнометром. В качестве растворителя использовали раствор NaOH (0,05 н.). При проведении изменений вязкости поддерживалась постоянная температура (25±1°С).

Результаты исследования. Интактные и облученные образцы плазмы и сыворотки. Белки плазмы и сыворотки крови спортсменов при хроматографии на тонком слое сефадекса G-200 разделяются на 3 фракции, которые в порядке возрастания скорости перемещения на хроматографическом планшете, соответствующем увеличению молекулярной массы белков, были обозначены как А, В и С (табл. 1).

Расчет процентного содержания белков в отдельных фракциях показал, что наибольшее количество белка присутствует в "медленной" (низкомолекулярной) фракции А, причем по содержанию белка в этой фракции, а также во фракции В плазма и сыворотка достоверно не отличаются. Они отличаются по содержанию белка только во фракции С (в плазме оно выше). Это позволяет предположить, что среди плазменных белков фракции С в процессе хроматографии перемещается фибриноген, входящий в ее состав.

Таблица 1. Характеристика фракционного состава белков интактных образцов плазмы и сыво-ротки крови спортсменов, x±S_x

* - отличие от показателей для плазмы достоверно (оценка по критерию знаков, р <0,01); остальные различия недостоверны.

Таблица 2. Влияние УФИ (240-390 нм) на характеристики фракционного состава белков плазмы и сыворотки крови спортсменов, x±S_x

* - отличие от контроля достоверно (оценка по критерию знаков, р<0,05); остальные различия недостоверны.

Следует отметить, что величины скорости передвижения белков Rf всех трех фракций плазмы достоверно значительно выше, чем значения Rf, для соответствующих фракций сыворотки крови.

При сравнении относительной вязкости фракций белков плазмы и сыворотки обнаружена достоверно несколько большая величина данного показателя для фракции В плазмы по сравнению с таковой для сыворотки.

После УФО плазмы статистически достоверное изменение содержания белков в ее фракциях по сравнению с контролем наблюдалось только при максимальной дозе облучения (2416 Дж/м²). Во фракции А выявляется тенденция к снижению уровня белка до 52,9 %, а содержание белков во фракциях В и С возрастает соответственно до 25,2 и 21,4 % (см. табл. 2).

После УФО сыворотки крови в малых дозах (75, 151, 302, 604 Дж/м²) процентное содержание белка во всех трех фракциях достоверно не отличается от контроля. Облучение в дозах 1208 и 2416 Дж/м² вызывает уменьшение содержания белков фракции А по сравнению с контролем соответственно на 8,0 и 13,0 %; при одновременном возрастании количества белка во фракции С соответственно на 6,3 и 10,5 %; содержание белка во фракции В при этом не меняется (см. табл. 2).

Нами также проведено исследование влияния УФИ на содержание общего белка в плазме и сыворотке крови спортсменов. Оно показало, что воздействие УФИ в дозах 1208 и 2416 Дж/м² не вызывает кристаллического препарата сывороточного альбумина человека методом тонкослойной хроматографии на сефадексе G-200 нами были получены 3 белковые фракции. Процентное содержание белка в самой "медленной" (низкомолекулярной) фракции А составило 62,6±0,6 % от суммарного количества белка. Более быстрая фракция В содержала 22,3±0,5 % белка, а наиболее подвижная фракция С - 14,9±0,2 % (n = 16). После облучения растворов альбумина в дозе 2416 Дж/м² наблюдаются снижение процентного содержания белка в низкомолекулярной фракции А до величины 58,1±0,6 % (р<0,001) и возрастание количества белка в двух других (более высокомолекулярных) фракциях до величин 24,6±0,6 % (р<0,01) и 17,2±0,6 % (р <0,001) соответственно.

Обсуждение результатов исследования. Согласно имеющимся данным [15] наименее подвижная при хроматографии в тонком слое геля фракция сыворотки и плазмы крови человека (А) имеет константу седиментации 4S и содержит главным образом альбумины, а также небольшое количество α1-гликопротеинов и трансферрина. Более подвижная фракция (В) имеет константу седиментации 7S и включает в себя преимущественно γ-глобулин. Самая быстрая фракция (С), характеризующаяся константой седиментации больше 12S, состоит в основном из α2-глостатистически достоверного изменения в содержании общего белка в облученных образцах по сравнению с необлученным контролем за исключениями: фракции А, В и С плазмы - 2416 Дж/м²; С - 1208 Дж/м²; фракции А и С сыворотки - от 1208 до 2416 Дж/м².

Скорости передвижения Rf белков фракций В и С плазмы крови под влиянием всех использованных доз УФИ не изменялись и только Rf белков фракции А плазмы достоверно возрастали при максимальной (2416 Дж/м²) дозе облучения.

Облучение сыворотки крови УФИ в дозах 75- 2416 Дж/м² не оказывает влияния на величины Rf белков фракции A. Скорость движения Rf белков фракции В сыворотки при дозе облучения 1208 Дж/м² достоверно увеличивается на 10,9 %, а при дозе облучения 2416 Дж/м² - на 10,7 % по сравнению с Rf этой фракции необлученного образца. Скорость движения Rf белков фракции С достоверно возрастает на 7,2 % после облучения сыворотки крови при дозе 2416 Дж/м².

Облучение плазмы вызывает повышение относительной вязкости белков всех трех фракций. Ее статистически достоверное возрастание наблюдается при больших дозах облучения: фракции А - при дозе 2416 Дж/м², В - от 604 до 2416 Дж/м², С - от 1208 до 2416 Дж/м².

Исследование влияния УФИ на относительную вязкость отдельных белковых фракций сыворотки показало, что при увеличении дозы облучения до 1208 и 2416 Дж/м² происходит статистически значимое уменьшение относительной вязкости белков фракции А соответственно на 2,1 и 2,3 %. Постепенное возрастание величин относительной вязкости белков фракций В и С отмечается с ростом доз УФИ от 151 до 2416 Дж/м² (р<0,05).

Нативные и облученные образцы сывороточного альбумина. При исследовании водного раствора булинов и иммуноглобулинов М.

Методом тонкослойной хроматографии на сефадексах не выявлено различий между фракционным составом необлученных и УФ-облученных в дозах 75 - 2416 Дж/м² белков сыворотки и плазмы спортсменов. Количество фракций белков до и после облучения оставалось равным трем. Белки плазмы и сыворотки крови спортсменов довольно однотипно отвечают на воздействие УФИ. Малые дозы УФИ (75 - 604 Дж/м²) не индуцируют фотодеструктивных изменений в молекулах белков плазмы и сыворотки. Это следует из анализа хроматографических данных, показавших, что процентное содержание и величины относительной подвижности белковых фракций достоверно не меняются по сравнению с контрольными образцами.

Процентное содержание белков фракции А с увеличением дозы УФО уменьшается и в плазме, и в сыворотке крови. Но после облучения сыворотки это уменьшение составляет около 13 %, а после облучения плазмы - всего 6,6 %. В обоих случаях наблюдается возрастание процентного содержания белков фракции С. Однако в облученной сыворотке увеличение процентного содержания данной фракции по сравнению с контролем составляет около 10,5 %, а в облученной плазме - около 3,4 %. Кроме того, УФО плазмы приводит к незначительному нарастанию количества белка во фракции В (на 3 %). Выявленная нами меньшая по сравнению с сывороткой крови степень изменения процентного содержания белков во фракции А и С после УФО плазмы (т. е. меньшая УФ-чувствительность плазмы крови по сравнению с сывороткой), возможно, обусловлена экранирующим действием присутствующего в ней фибриногена. Для понимания природы обнаруженного явления это предположение открывает существенные возможности в применении здесь методологических положений функциональной теории помехоустойчивости организма [3]. В самом деле, молекула фибриногена содержит значительное количество хромофоров УФИ: аминокислотных остатков тирозина (96), триптофана (52), фенилаланина (90), цистина (28) [14]. Большая поверхность молекулы (вытянутый эллипсоид), наличие дисульфидных связей, присутствие большого числа ароматических аминокислот, поглощающих УФИ, позволяют предположить, что при УФО плазмы фибриногеном поглощается значительная часть энергии УФИ. Здесь действие фибриногена никак не дефинируется реакцией резистентности. Мы наблюдаем действие молекул фибриногена, экранирующее влияние смоделированных нами УФЛ. Эти лучи несут с собой ультрафиолетовое излучение, выступающее в качестве помехи. Такая интерпретация УФИ позволяет идеям функциональной теории помехоустойчивости организма [3] транслироваться в трансфузиологию.

Еще одним из проявлений свойств помехоустойчивости является и то, что наблюдаемое после облучения изменение процентного содержания белков во фракциях плазмы и сыворотки крови спортсменов при неизменном количестве в них общего белка, вполне может быть связано с перераспределением белка между отдельными фракциями. Мы считаем, что уменьшение количества белка во фракции А после облучения обусловлено фотополимеризацией части белковых молекул, входящих в ее состав (например, альбумина, составляющего около 50 % от всех белков плазмы и сыворотки), и их перемещением вследствие этого из более низкомолекулярной фракции А в высокомолекулярную фракцию С (в случае облучения сыворотки), а также во фракцию В (в случае облучения плазмы крови).

Возможность протекания подобного процесса следует из результатов наших модельных опытов с использованием сывороточного альбумина человека. В этих экспериментах под воздействием УФИ также наблюдается переход части молекул сывороточного альбумина из низкомолекулярной фракции А в более высокомолекулярные - В и С.

Явления агрегации и сшивания молекул сывороточного альбумина человека под воздействием больших доз УФИ (29х104 Дж/м²) до нас наблюдали методом гельфильтрации на сефадексах [9], а ранее у бычьего сывороточного альбумина методами ультрацентрифугирования и спектрофотометрии [16].

Изменения формы белковых молекул после УФО также можно считать результатом помехоустойчивого действия системы крови к воздействию УФИ. Об изменениях формы белковых молекул после облучения плазмы и сыворотки говорит возрастание величин Rf их отдельных фракций. С точки зрения теории помехоустойчивости это может быть связано с двумя причинами: с увеличением кажущейся молекулярной массы этих белков после воздействия УФЛ; с частичной полимеризацией белковых молекул.

Еще одним примером результата помехоустойчивого действия системы крови к значительным дозам УФО являются конформационные перестройки молекул белков. Большие дозы УФО (604 - 2416 Дж/м²) плазмы и сыворотки крови приводят к возрастанию относительной вязкости фракций В и С, что свидетельствует об увеличении относительных объемов растворенных белков этих фракций.

Таким образом, наиболее фотопомехочувствительной группой белков в сыворотке и плазме крови спортсменов, по данным хроматографии, оказались белки фракции С, несколько меньшей фоточувствительностью обладали белки фракции А, а наиболее фотостабильными были белки фракции В (γ-глобулины). В трактовке идей настоящей работы фотопомехочувствительность рассматривалась нами как одно из свойств помехоустойчивости белков.

1. Путем варьирования доз при УФО крови методами, близкими к АУФОК, можно:

а) влиять на помехоустойчивость крови спортсменов, т. е. на активность и содержание ее экранирующих свойств;

б) целенаправленно изменять структурное состояние белков фракций А и С плазмы и тем самым влиять на их функциональную активность (транспортные функции крови, интенсивность обменных процессов, срочность и скорость иммунных реакций и т. д.).

2. Для более широкой трансляции в практику сделанных в п.1 выводов необходимо:

а) проведение детальных клинико-биохимических сопоставлений;

б) сравнительное структурно-функциональное исследование облученной и необлученной крови спортсменов с таковыми у группы лиц, не занимающихся спортом (численный состав всех групп сравнения и наблюдения должен быть максимально расширен до объема не менее 10 000 респондентов).

1. Бутурлакин М. С. Изучение некоторых биохимических показателей тканей птиц и оптических свойств белков при воздействии ультрафиолетового и рентгеновского излучений: Автореф. канд. дис. Воронеж, 1990. - 21 с.

2. Детерман Г. Гель-хроматография. М., 1990. - 252 с.

3. Елисеев Е. В. Помехоустойчивость организма спортсмена: структура, механизмы, адаптация. - Челябинск: Экодом, 2003. - 357 с.

4. Иванова М. Н., Демеш К. В., Жуков Ю. А. Установка для измерения вязкости биологических жидкостей. Рац. предложение № 178 от 29.05.80. - Воронеж: ВГУ, 1980.

5. Лазарев Л. А. Белки сыворотки крови при хронической недостаточности кровообращении: Автореф. канд. дис. Ижевск, 1999, - 13 с.

6. Мартин Р. Введение в биофизическую химию. М., 1996. - 129 с.

7. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.,1991. - 247 с.

8. Пасынский А. Г. Действие радиации на белки и нуклеиновые кислоты в растворе и в поверхностях раздела. - В кн.: Первичные и начальные процессы биологического действия радиации. М., 1993, с. 35-37.

9. Першина В. П., Хинох М. А. Действие УФ-излучения на смеси ферментов. - В кн.: Фотобиология животной клетки. Л., 1999, с. 49-52.

10. Попов Ю. В., Лазарев Д. Н. Аппаратура для УФ-облучения крови. Сб. статей, 1990, с. 11-18.

11. Провоторов В. М., Должикова Т. П., Никитин Г. В. Аппарат для тонкослойной гель-фильтрации // Лаб. дело. 1999, № 4, c. 246-248.

12. Русаков В. М., Скобелев Л. И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М., 1983. - 224 с.

13. Самойлова К. А., Миронова А. П., Арцишевская Р. А. Выход веществ из лимфоцитов периферической крови человека, облученных коротковолновыми УФ-лучами // Цитология, 1994, т. 26, № 1, с.102-107.

14. Хаггис Дж., Михи Д., Мюир А. и др. Введение в молекулярную биологию. М., 1997. - 434 с.

15. Flоdin P., Killandеr I. Fractionation of human serum proteins by gel filtration // Bioсhim. biophys. acta. 1992, vol. 63. - Р. 403.

16. Glaesson I. М. Effect of ultraviolet light (2533 A) on Helix pomatia hemocyanin and bovine serum albumine as studied by the changes in the ultraviolet spectrum and sedimentation behaviour. - Ark. kemi, 1996, bd 10, - Р.1-6.